Introdução: O câncer colorretal é um dos mais frequentes no mundo ocidental, com 1,2 milhão de pessoas diagnosticadas em todo o mundo, a cada ano. A maioria dos casos de câncer colorretal é esporádica, decorrente de instabilidade de cromossomos e displasia de adenomas para carcinomas, enquanto as síndromes da polipose adenomatosa familiar e de câncer colorretal não polipose hereditário surgem por mutações no gene APC da linha germinativa e na via da instabilidade do microssatélite. A disbiose e a inflamação crônica associada já foram previamente estabelecidas na doença inflamatória intestinal, na síndrome do intestino irritável e no Diabetes mellitus tipo 2, e agora são conhecidas por facilitar a carcinogênese no câncer colorretal através de mecanismos genéticos e epigenéticos. A bactéria disbiótica que aparece principalmente implicada no câncer colorretal é o Fusobacterium nucleatum, associada à instabilidade dos microssatélites e às metástases linfonodais. Estudos clínicos recentes também sugeriram que eles podem afetar o prognóstico e potencialmente sinalizar uma nova fronteira no diagnóstico, avaliação e tratamento do câncer colorretal. Objetivos: Revisar sistematicamente a literatura para reunir as evidências que investigam as associações entre a microbiota intestinal e câncer colorretal, adenomas colorretais, local do câncer colorretal, estágio da doença, prognóstico, sobrevida e efeito da terapia atual realizada para o tratamento do câncer colorretal. Metodologia: Uma revisão sistemática e meta-análise da literatura publicada. Resultados: 53 estudos foram considerados relevantes para inclusão, abrangendo um total de 5167 pacientes com câncer colorretal, dos quais 3754 foram testados através de amostras de tecido da mucosa, 1072 através de amostras de fezes e 341 através de uma combinação. Conclusão: Existe uma associação significativa entre a microbioma intestinal e o câncer colorretal, com destaque para Fusobacterium (gênero) e F. nucleatum (espécies). Essa associação parece existir mais nos estágios avançados do tumor e / ou adenoma e é frequentemente associada a pior prognóstico e menor sobrevida.








Mari Uyeda é coordenadora de pós graduação e docente na UNYLEYA e na Pólis Cursos, e doutoranda no AC Camargo Cancer Center.

Palavras-chave: Câncer colorretal, F. nucleatum, microbioma intestinal, disbiose.

Introdução:

O carcinoma colorretal (CCR) é um dos tumores malignos mais comuns do trato digestivo, considerado uma grande preocupação de saúde pública atualmente ¹. No geral, o CCR ocupa o quarto lugar em incidência (9,2% do total de casos de câncer), mas o segundo em termos de mortalidade (9,2% do total de mortes por câncer) ¹. O mecanismo de malignidade do CCR não foi completamente estabelecido. A ocorrência de CCR é um processo multifatorial e de várias etapas, causado pela sinergia do ambiente, dieta e estilo de vida junto com fatores genéticos, enquanto a inflamação foi identificada como importante fator de risco.

O CCR é uma das neoplasias mais comuns no mundo ocidental, com 1,2 milhão de pessoas diagnosticadas em todo o mundo, a cada ano. ² É a quarta causa mais comum de mortalidade por câncer em todo o mundo ³ e, embora programas de triagem baseados em exames de sangue oculto nas fezes e colonoscopia subsequente tenham demonstrado reduzir a mortalidade em 16%,⁴ 70-90% dos pacientes apresentam sintomas já desenvolvidos.⁵ No Reino Unido, mais pacientes são diagnosticados no estágio III-IV (52-56%) do que nos estágios I-II (44-48%), ⁶ e a incidência em pacientes mais jovens está crescendo. ⁷ A sobrevida em cinco anos no Reino Unido permanece em 59% para os homens. ⁸

A maioria dos casos de CCR é esporádica, decorrente de instabilidade cromossômica e displasia de adenomas para carcinomas,⁹ enquanto as síndromes hereditárias de polipose adenomatosa familiar (PAF) e de câncer colorretal não-polipose (HNPCC, da sigla em inglês) surgem devido a mutações no gene APC da linha germinativa ¹⁰ e na via da instabilidade do microssatélite. ¹¹ Além disso, uma via serrilhada que se pensa estar centrada na mutação BRAF e na hipermetilação do promotor de genes foi descrita. ¹²

O microbioma intestinal

O microbioma intestinal é conhecido por desempenhar papéis importantes na função e no bem-estar dos órgãos humanos. As bactérias do cólon são essenciais na digestão de carboidratos, proteínas e ácidos graxos. ¹³ A função mucosa da barreira epitelial ¹⁴ e a estimulação tônica para a imunidade sistêmica ¹⁵ são essenciais na formação saudável das células T auxiliares e na imunidade adquirida, e são alcançadas por meio de um equilíbrio intrincado entre o hospedeiro e o microbioma. Este equilíbrio é profundamente sensível a uma ampla gama de fatores e estressores induzidos por mudanças na dieta, ¹⁶ exercício, ¹⁷ ambiente, ¹⁸ oxigenação e isquemia.¹⁹ Foi demonstrado que mudanças na dieta em um período tão curto quanto 24 horas alteram reversivelmente a composição do microbioma intestinal, com a reversão de volta à linha de base em 48 horas se a dieta não for continuada. Foi demonstrado que dietas ricas em açúcares reduzem a intensidade relativa de espécies de bacteroides em seres humanos ²⁰ e isso foi refletido em diabéticos tipo 2 que apresentam proporção aumentada de Firmicutes: Bacteroidetes.

Disbiose intestinal e câncer colorretal

A disbiose (uma preponderância de bactérias patogênicas e a redução de micróbios benéficos) e a inflamação crônica associada já foram implicadas anteriormente na doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável e Diabetes mellitus tipo 2 ²¹ e agora são conhecidas por facilitar a carcinogênese na CCR por meio de mecanismos genéticos e epigenéticos. ²²

A bactéria atual de maior interesse na disbiose intestinal do CCR é a Fusobacterium nucleatum, um anaeróbio gram-negativo normalmente prevalente na cavidade oral. ²³ Em estudos de laboratório, F. nucleatum demonstrou aumentar a carga tumoral em camundongos, ²⁴ mesmo na ausência de um modelo pré-existente de inflamação por colite através da expressão de marcadores pró-inflamatórios e de fatores de virulência, como a adesão ao FadA da superfície epitelial para infiltrar-se no epitélio do cólon e ativar a via de sinalização beta-catenina / WNT, ²⁵ promovendo a carcinogênese. Em humanos o F. nucleatum ajuda as células cancerígenas a construir o microambiente do tumor e a se beneficiar da sua resistência à quimioterapia. Os elementos constituintes do ambiente tumoral, incluindo neutrófilos, macrófagos e linfócitos contribuem para a existência de células tumorais. ²⁶

A F. nucleatum também demonstrou desempenhar papel na modulação da resposta imune nas células humanas, causando apoptose das células T ao interromper a fase do ciclo celular G1 ²⁷ e expandir as células imunes mieloides que inibem a proliferação e a funcionalidade das células T clonais. ²⁸

Os mecanismos mais importantes de F. nucleatum envolvidos na carcinogênese do CCR são a modulação imunológica (como o aumento de células supressoras derivadas de mieloides e receptores inibidores de células natural killers), fatores de virulência (como FadA e Fap2), microRNAs (como miR-21) e metabolismo de bactérias. ²⁹

Estudos clínicos recentes mostraram que F. nucleatum é enriquecido em vários adenomas colorretais e carcinomas; ^30,31 assim como mostraram seu envolvimento na sequência adenoma-carcinoma. ^32,33 F. nucleatum também demonstrou estar associado a altos graus de instabilidade de microssatélites e ao metilador das ilhas CpG. ³⁴ Algumas evidências mostram, ainda, que F. nucleatum está associado a maior estadiamento do CCR e pior prognóstico, ^35,36 e desempenha papel na modulação da quimiorresistência no CCR. ³⁷

O subtipo molecular enterotoxigênico da Bacteroides fragilis produz uma toxina que impulsiona a produção de mediadores inflamatórios através da via de sinalização Wnt, ³⁸ induzindo colite em um modelo murino. ³⁹ Em humanos, há evidências de que ela está associada ao CCR em estágios avançados. ⁴⁰

Peptrostreptococcus demonstrou aumentar a proliferação de células do cólon e aumentar espécies reativas intracelulares de oxigênio, levando à displasia em um modelo murino. ⁴¹ Também demonstrou ser enriquecido em tecido de CCR. ⁴² As espécies de Porphyromonas também foram associadas ao CCR, sendo que as bactérias orais foram encontradas enriquecidas no CCR. ⁴³

A alteração do microbioma intestinal no CCR também é caracterizada por uma redução em certos táxons bacterianos que são abundantes na eubiose, com funções e propriedades protetoras. Estes incluem Bifidobacterium, Ruminococcus e Facaelibacterium. ⁴⁴ Faecalibacterium prausnitzii reduz a atividade de NF-kB e reduz citocinas pró-inflamatórias. ⁴⁵ Gêneros como o Faecalibacterium demonstraram estar esgotados em estudos clínicos em pacientes com CCR; ⁴⁶ pensa-se que a depleção de tais comensais por mecanismos incompletos permite a proliferação do microbioma disbiótico.

Cirurgia e disbiose intestinal

Os efeitos iatrogênicos da cirurgia também causam mudanças profundas no microbioma bacteriano, cuja extensão e importância permanecem incompletos. ⁴⁷ A colectomia expõe os segmentos do intestino ao oxigênio e à isquemia temporária através da ligação arterial, que demonstrou alterar o microbioma; algumas espécies de bactérias demonstraram ser protetoras na redução de lesões mucosas subsequentes em modelos murinos. ⁴⁸

Além disso, os efeitos e implicações clínicas de preparação mecânica do intestino no microbioma intestinal, com pacientes em jejum e uso de antibióticos antes da cirurgia, ainda não foram totalmente compreendidos. Tais medidas foram baseadas no entendimento tradicional da profilaxia infecciosa, com o objetivo de diminuir o conteúdo luminal intestinal e a carga bacteriana. A preparação mecânica do intestino muda instantânea e drasticamente o microbioma intestinal, com um estudo mostrando diminuição de 31 vezes na carga microbiana total e levando cerca de 14 dias para recuperar a linha de base. ⁴⁹ A combinação de jejum, preparação mecânica do intestino, administração de antibióticos, juntamente com o estresse fisiológico da isquemia e oxigenação dos tecidos, pode dar aos patobiontes a oportunidade de proliferar em meio à supressão de espécies comensais. Alterações anatômicas após ressecção cirúrgica são outra consideração. ⁵⁰ Cada vez mais, tem surgido evidências da importância de tais mudanças no microbioma intestinal, na recuperação e em complicações, como o vazamento anastomótico. ⁵¹

Métodos

Foi realizada uma revisão sistemática da literatura, de acordo com os itens de relatório preferidos da revisão sistemática e metanálise (PRISMA). ⁵² Foram realizadas pesquisas na literatura sobre o PubMed por meio da interface Advanced Search e EMBASE com pesquisa avançada do NHS Healthcare Databases, usando termos MeSH, termos de pesquisa e operadores booleanos com sinônimos e plurais, além de palavras-chave. Foram excluídos estudos com menos de 10 participantes com CCR, estudos com animais, relatórios ou séries de casos, resumos ou procedimentos de conferências. Os estudos incluídos tiveram dados extraídos (se disponíveis) sobre a natureza do estudo: tamanhos de amostras de grupos de pacientes relevantes (normalmente CCR, doença adenomatosa e controles saudáveis), idade média dos pacientes com CCR, qualquer tratamento cirúrgico prévio para CCR, o tipo de amostra do estudo (normalmente amostras de mucosas ou fezes) e a técnica de detecção usada. Os estudos foram divididos por táxon bacteriano e depois subdivididos, considerando aqueles que investigam amostras de tecido da mucosa e amostras de fezes. Os estudos de tecido mucoso foram então subdivididos naqueles comparados com grupos controle saudáveis ​​ou com tecido normal adjacente pareado.

As associações pertinentes de bactérias intestinais relevantes com CCR ou adenoma, bem como associações com a localização do tumor foram observadas. Profundidade de invasão, metástase linfonodal, metástase distante, idade do paciente, estadiamento geral e, finalmente, quaisquer implicações prognósticas ou preditivas também foram observadas. Todos os artigos incluídos foram avaliados quanto à qualidade metodológica, utilizando uma ferramenta modificada da colaboração Cochrane para avaliar o risco de viés. ⁵³

Resultados:

Um diagrama PRISMA é mostrado abaixo (Figura 1), onde os critérios de inclusão e exclusão foram aplicados e resultaram em 53 estudos relevantes para serem incluídos nesta revisão, com um total de 5167 pacientes com CCR, dos quais 3754 foram testados em amostras de tecido da mucosa, 1072 em amostras de fezes e 341 em uma combinação (idades médias de 65,66, 61,74 e 68,78 com base nos dados disponíveis). Não foram encontrados ensaios clínicos randomizados, sendo a grande maioria estudos de coorte ou caso-controle. O 16rRNA e a PCR quantitativa foram as técnicas mais comuns de análise de microbiomas. A demografia e os resultados dos dez estudos mais relevantes estão resumidos na Tabela 1.

Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) e seu gênero Fusobacterium (Filo: Fusobacteria, Ordem: Fusobacteriales, Família: Fusobacteriaceae) foram os táxons mais comumente investigados no microbioma do CCR.  Todos os estudos usaram um mínimo de sequenciamento de RNA (geralmente usando um método de sequenciamento de 16rRNA de amplicons) e oito estudos complementaram isso com a PCR. Kostic et al. ^24,33 usaram adicionalmente técnicas de sequenciamento genômico completo e FISH em seus dois estudos, respectivamente.

Para 219 pacientes com CCR, a presença ou abundância de Fusobacterium foi comparada em grupos controle saudáveis. Os pacientes com CCR compararam com o tecido normal adjacente correspondente, biopsiado dos mesmos pacientes. Um total de 656 pacientes com CCR e 634 amostras de CCR foram examinados.

Com relação ao Gênero de Fusobacterium no tecido mucoso do CCR versus (vs.) grupos controle saudáveis, 219 pacientes com CCR mostraram uma associação positiva significativa (p <0,05) entre Fusobacterium e CCR. Flemer et al. ⁵⁴ identificaram aumento da abundância de unidade taxonômica operacional (OTU) pertencentes a vários gêneros, particularmente aqueles relatados como patógenos orais, incluindo Fusobacterium. Gao et al. ³⁰ identificaram que o microbioma CCR era significativamente diferente daquele dos controles, com um nível significativamente aumentado de Fusobactérias e Firmicutes no nível do filo (p <0,001); Fusobacterium no nível de gênero também foi significativamente enriquecido (p = 0,032).

Com relação ao Gênero de Fusobacterium no tecido mucoso da CCR vs. tecido não neoplásico adjacente correspondente, um total de 437 pacientes com CCR foram analisados e mostraram uma associação positiva significativa entre Fusobacterium no tumor vs. amostras adjacentes. Allali et al. ⁵⁵ compararam amostras de tumores de duas coortes dos EUA e da Espanha (total de 45 pacientes com CCR) e descobriram que o Fusobacterium aumentou significativamente na coorte espanhola (n = 23, p <0,0001) e esse resultado também foi encontrado por Burns et al. ⁵⁶

Kostic et al. ³³ descobriram que Fusobacterium foi positivamente associado a 95 amostras de CCR vs. tecido pareado; qPCR confirmou abundância significativamente aumentada (p <0,0003). Esses achados são condizentes com o sequenciamento genômico completo, que revelou sequências de Fusobacterium significativamente enriquecidas nos metagenomas do CCR. O FISH 16rRNA subsequente visualizou a expressão de Fusobacterium em células CCR que foram novamente enriquecidas vs. tecido não neoplásico correspondente.

Nakatsu et al. ⁵⁷ usaram uma abordagem de modelagem baseada no sequenciamento de 16rRNA e nos modelos de mistura multinominal de Dirichlet para identificar cinco grupos diferentes de bactérias da metacomunidade. A metacomunidade E. compreendendo Fusobacterium e outras bactérias orais e patogênicas foram significativamente associadas (q <1,0x10-5) a CCR e adenomas; no total, 40% dos adenomas e 48% de todos os CCR foram classificados como pertencentes a esse grupo.

Em relação ao Gênero Fusobacterium em amostras de fezes de CCR: para 326 pacientes com CCR foi comparada a abundância de Fusobacterium em relação a grupos controle saudáveis e os resultados mostraram associação positiva significativa entre Fusobacterium e CCR.

Em relação ao Gênero de Fusobacterium em adenomas: tecido da mucosa vs. controles saudáveis ​​ou tecido adjacente compatível, foi observada associação positiva significativa. Kostic et al. ²⁴ encontraram Fusobacterium enriquecido (p <0,004) em 48% dos adenomas (n = 29) vs. tecido normal adjacente. Nakatsu et al. ⁵⁷ descobriram que a metacomunidade, incluindo Fusobacterium e patógenos orais semelhantes, estava significativamente associada a adenomas e carcinomas (q <1,0x10-5), em comparação com controles saudáveis. Xu et al. ⁵⁸ não encontraram diferença significativa entre adenomas e grupos normais.

Em relação ao Gênero de Fusobacterium em adenomas: amostras de fezes vs. controles saudáveis, um total de 328 pacientes com CCR foram avaliados para verificar a existência de uma diferença significativa entre Fusobacterium em amostras de fezes de adenoma e controles saudáveis. Kostic et al. ²⁴ (n = 28) encontraram aumento significativo (p <5 × 10−3) em comparação com controles saudáveis. Yu et al. ⁵⁹ (n = 47) também encontraram aumento significativo e curiosamente observaram progressão significativa na abundância de Fusobacterium da doença adenomatosa normal para a doença carcinomatosa (p = 0,034). Amitay et al. ⁶⁰ (n = 223) não encontraram associação entre controles normais e qualquer tipo de adenoma (adenoma não avançado n = 110, adenoma avançado, isto é, displasia tubulo-vilosa, vilosa ou de alto grau ≥1cm), assim como Zackular et al. ⁶¹ (n = 30).

Em relação ao Gênero de Fusobacterium no tecido mucoso ou nas fezes da CCR vs. adenomas, Amitay et al. ⁶⁰ encontraram Fusobacterium (q <0,001) no filo e Fusobacterium (p <0,01) no nível de gênero como sendo significativamente enriquecido em CCR vs. adenomas. Zackular et al. ⁶¹ detectaram que a OTU atribuída a Fusobacterium apresentava maior abundância relativa (p <0,001) na CCR vs. adenomas.

Em Zackular et al. ⁶¹ (30 CCR, adenomas e pacientes saudáveis), idade, raça e IMC foram preditivos de carcinomas (AUC = 0,798; IC95%: 0,686-0,910; p <0,001) nas fezes vs. controles normais. Amitay et al. ⁶⁰ (44 pacientes com CCR, 223 adenomas, 193 controles saudáveis) mostraram que um modelo preditivo baseado apenas em Fusobacterium para CCR vs. o restante da população estudada apresentava uma AUC de 0,676, que subiu para 0,715 quando combinada com idade e sexo. Não foi encontrado que o Fusobacterium melhorasse a previsão entre adenomas avançados ou não avançados e controles saudáveis.

Identificamos que 1532 pacientes com CCR e 1031 amostras, encontraram uma associação positiva significativa entre F. nucleatum e CCR vs. tecido normal adjacente correspondente.

Em relação ao F. nucleatum em amostras de fezes de CCR vs. controles saudáveis, 433 pacientes com CCR e 275 amostras apresentaram associação positiva significativa entre F. nucleatum e CCR. Liang et al. ⁶² mostraram que F. nucleatum é significativamente mais abundante na CCR com base na metagenômica, confirmada pelos controles qPCR (P <0,0001), com valor preditivo (AUROC de 0,868 (P <0,0001)).

Em relação às espécies de F. nucleatum em amostras de tecido mucoso ou fezes adenomatosas vs. tecido normal ou controles saudáveis, um total de 115 pacientes com CCR tiveram estudados o tecido mucoso e constataram que F. nucleatum é significativamente enriquecido em adenomas vs. tecido normal. Flanagan et al. ³⁵ (n = 52) descobriram que F. nucleatum não era significativamente mais abundante na PCR vs. tecido adjacente normal compatível para todos os adenomas, mas enriquecido significativamente na displasia de alto grau (p = 0,015). McCoy et al.⁶³ (n = 67) também encontraram aumento da abundância de F. nucleatum em comparação aos controles (p = 0,01). Indivíduos com F. nucleatum alto (em comparação com o tercil mais baixo) também apresentaram probabilidade significativamente maior de ter adenomas (OR 3,66, IC 95% 1,37-9,74, p = 0,005).

Em relação às espécies de F. nucleatum em amostras de tecido mucoso ou fezes de CCR vs. Adenomas, Ito et al. examinaram a expressão de F. nucleatum em pólipos hiperplásicos (n = 129), adenomas serrilhados sésseis (n = 120), adenoma séssil tradicional (n = 94), adenomas não serrilhados (n = 122) e CCRs (n = 511). F. nucleatum foi positivo em 24% dos pólipos hiperplásicos (HPs), 35% dos adenomas séssil serrilhados (SSAs), 30% dos adenomas séssil tradicionais (TSAs), 33% dos adenomas não serrilhados e 56% dos CCRs. A positividade de F. nucleatum foi encontrada significativamente mais frequente no CCR do que em todos os grupos (p <0,0001).

Em relação à F. nucleatum no tecido mucoso e estadiamento CCR, foi estudado um total de 1784 pacientes com CCR e foi encontrado uma associação positiva significativa entre F. nucleatum e um elemento do estadiamento da CCR. Mima et al. ⁶⁴ examinando 1069 pacientes com CCR constataram que F. nucleatum está significativamente associado ao maior estadiamento pT (p = 0,0003 ep = 0,0007 em análises uni e multivariáveis), mas não nos estágios pN ou M. Da mesma forma, Wei et al. ³⁶ estudaram 180 pacientes com CCR e descobriram que uma alta abundância de F. nucleatum estava associada ao aumento da profundidade de invasão do tumor (p = 0,015) e metástase linfonodal (p = 0,011). Yan et al.³⁷, que estudaram 280 pacientes com CCR estágio III / IV, encontraram F. nucleatum significativamente maior nos estágios III (p <0,001) e IV (p = 0,005) vs. tecido normal adjacente.

Mima et al. ⁶⁴ descobriram que a positividade de F. nucleatum estava associada a pior sobrevida específica para câncer (em comparação com casos negativos, taxas de risco multivariáveis ​​(HRs) para mortalidade específica para câncer em casos de F. nucleatum-baixo e F. nucleatum-alto foram 1,25 (95). % de intervalo de confiança (IC), 0,82 a 1,92) e 1,58 (95% CI, 1,04 a 2,39), respectivamente. A alta abundância de F. nucleatum também foi associada a menor sobrevida específica do câncer, p = 0,023). Wei et al. ³⁶ encontraram associação com pior sobrevida global em três anos (p = 0,003) e sobrevida livre de doença (p = 0,001).

Yan et al.³⁷ descobriram que o alto nível de F. nucleatum associou-se a uma sobrevida específica do câncer significativamente pior (p <0,001) e sobrevida livre de doença (DFS) (p <0,001), e foi um fator de risco independente para ambos. O tratamento com quimioterapia adjuvante com CSS (p <0,001) e DFS (p <0,001) foi associado a um resultado clínico significativamente melhor em ambos os pacientes com baixo nível de F. nucleatum (CSS: p <0,001, DFS: p <0,001) e alto nível de F. nucleatum (CSS: (p = 0,034, DFS: p = 0,024), mas pacientes com baixos níveis de F. nucleatum se beneficiam mais da CA vs. alta (DFS p = 0,048).

Em relação à F. nucleatum nas fezes e CCR; estadiamento e prognóstico, 185 pacientes com CCR foram investigados e foi encontrada associação positiva significativa entre F. nucleatum e estadiamento. Yu et al. ⁶⁵ (44 pacientes com CCR examinados) encontraram F. nucleatum significativamente associado ao estadiamento AJCC III (p = 0,022) e tamanho do tumor> 15cm³ (p = 0,018). Análise da curva característica do operador receptor baseado em F. nucleatum para prever a recorrência de CCR foi significativamente superior ao modelo baseado na AJCC (0,776 vs. 0,646, p = 0,039) e uma alta quantidade de F. nucleatum foi fortemente associada à menor sobrevida livre de recorrência.

Zeller et al. ⁶⁶ encontraram várias subespécies de F. nucleatum enriquecidas no estágio inicial do CCR (0 / I / II); F. nucleatum subsp. vincentii (p <1e-5) F. nucleatum subsp. animalis (p <1e-5) vs. amostras livres de tumor.

Discussão

O CCR continua sendo uma das principais causas de morbimortalidade, com uma incidência crescente que deve aumentar mais de 60% até 2030. ⁶⁷ Segundo a American Cancer Society em 2020 foram aproximadamente 147.950 novos casos de CCR, com aproximadamente 53.200 mortes entre os americanos ⁶⁸. O microbioma intestinal apresenta uma nova fronteira em nossa compreensão da patogênese do CCR e cada vez mais estamos entendendo que a alteração dos elementos do microbioma intestinal oferece novas oportunidades em nossa detecção, diagnóstico, estadiamento, investigação e tratamento do CCR. Devido às limitações em nossas atuais modalidades de triagem, compreender e estabelecer uma associação entre o microbioma intestinal e o CCR pode ser o primeiro passo em seu uso como biomarcador.

Nossa revisão sistemática mostrou que de fato existe uma associação significativa entre microbioma intestinal, incluindo, principalmente, Fusobacterium (gênero) e Fusobacterium nucleatum (espécies) e CCR. Isso está de acordo com a revisão sistemática publicada por Hussan et al. ⁶⁸ Todos os seis estudos que examinaram amostras de mucosa do gênero Fusobacterium vs. controles saudáveis ​​e 8 de 9 estudos que examinaram amostras de fezes mostraram que o Fusobacterium é significativamente enriquecido no CCR. Da mesma forma, todos os dez estudos que examinam F. nucleatum no tecido da mucosa e todos os quatro estudos que examinam amostras de fezes descobriram que F. nucleatum é significativamente enriquecido no CCR. Nosso estudo também identificou que outras espécies de Fusobacterium, incluindo F. periodonoticum ⁶⁹ e Fusobacterium oral taxon 370, ⁷⁰ e no nível de subespécie F. nucleatum subsp. vincentii e F. nucleatum subsp. animalis ⁶⁶ foram significativamente enriquecidos no CCR. Este projeto também destacou um vínculo importante entre Fusobacterium e estágio avançado do tumor e / ou baixa sobrevida a longo prazo.

A associação de Fusobacterium e CCR pode ser explicada em níveis moleculares e histopatológicos, pois isso está de acordo com nosso conhecimento existente sobre Fusobacterium, que demonstrou se infiltrar nas células epiteliais, expressando marcadores pró-inflamatórios ²⁴ e modulando a resposta imune. ²⁸. Dejea et al. identificaram biofilmes bacterianos demonstrando invasão bacteriana na massa tumoral. ⁷⁰ Além disso, a associação com Fusobacterium e o estágio avançado do tumor pode ser explicada pela teoria recente, que está ganhando evidências sobre o papel das bactérias orais (como Fusobacterium) no CCR, formando biofilmes, impulsionando a patogênese. Flemer et al. ⁷¹ identificaram redes bacterianas semelhantes em zaragatoas orais e mucosa colônica, dentro e fora do tumor; a adição de microbiota oral às identificadas nas fezes também melhorou a previsão de CCR e adenomas.

Os achados mais consistentes do enriquecimento de Fusobacterium e F. nucleatum vieram de estudos nas mucosas; embora o consenso tenha mostrado significância mesmo nas amostras de fezes. Existem variações nos métodos de extração e preservação de amostras de fezes, e outros fatores de confusão, incluindo o uso da preparação intestinal, tornando a modalidade menos robusta para a detecção de microbiomas intestinais associados a tumores.

O enriquecimento significativo de Fusobacterium (gênero) foi observado em dois de três estudos de mucosa e em dois de quatro estudos de fezes em adenomas colorretais vs. tecido ou controles saudáveis. F. nucleatum (espécie) foi similarmente misturado, com dois em cada quatro estudos mostrando uma diferença significativa nos adenomas vs. tecidos ou controles saudáveis. Isso pode estar relacionado à confiabilidade da amostragem de fezes como uma modalidade, ou pode estar de acordo com a observação de que o Fusobacterium está mais fortemente associado ao avanço da doença ao longo da sequência adenoma-carcinoma; ⁶⁵ não foi possível estratificar resultados agrupados de estudos identificados devido à heterogeneidade na especificação e inclusão de adenomas.

No entanto, observamos um forte enriquecimento em CCR vs. adenomas, em 3 de 3 de Fusobacterium (gênero) e 5 de 5 de F. nucleatum (espécies); todos os estudos de Fusobacterium foram de mucosa e os de F. nucleatum foi uma mistura de mucosas e fezes. Esta diferença significativa está no suporte de Fusobacterium e Fusobacterium nucleatum serem patogênicos no desenvolvimento de adenomas para CCR e, novamente, mais tarde na sequência de adenoma-carcinoma.

Não encontramos um consenso geral sobre a microbiota intestinal e a localização do tumor. No entanto, o maior estudo que investigou essa questão foi Mima et al.⁷² em uma coorte norte-americana de 1069 pacientes, que encontraram associação significativa entre maior nível de F. nucleatum e tumores mais proximais (p <0,001), com progressão linear do reto ceco ao longo do cólon.

Uma forte tendência nas evidências apontou para associação significativa entre F. nucleatum e estágio avançado de CCR, com pior prognóstico e menor sobrevida. Quatro dos cinco estudos de mucosa que examinaram o prognóstico encontraram associação positiva significativa com F nucleatum, produzindo um pior prognóstico para pacientes com CCR, e ambos os estudos de fezes (185 pacientes com CCR) encontraram uma associação positiva significativa entre F. nucleatum e estadiamento. Podem existir discrepâncias devido à heterogeneidade nos relatórios de estadiamento, com estudos relatando elementos dos sistemas TNM, Duke e AJCC.

Essa associação com estadiamento mais alto e pior prognóstico subsequente está de acordo com as evidências laboratoriais e a teoria de que F. nucleatum está patogenicamente implicada em adenomas e CCR mais avançados.

Nenhum estudo identificado investigou a associação do microbioma intestinal à ressecção cirúrgica ou intervenção na CCR, e essa é uma área de pesquisa que requer mais estudos.

Embora o escopo deste estudo forneça uma forte visão geral da associação da microbiota intestinal, existem várias limitações. A ausência de uma meta-análise devido à heterogeneidade de muitos dos estudos presentes limitará o escopo de algumas de nossas conclusões. Houve variações nos métodos de teste, estágio e localização do tumor. Além disso, toda a pesquisa publicada foi realizada em pacientes com doença estabelecida (CCR ou adenomas), sem pesquisa populacional para validar qualquer um dos modelos de previsão criados por alguns dos estudos.

Finalmente, há pouca evidência sobre o impacto da cirurgia no microbioma e mais pesquisas são necessárias. Existem estudos em andamento examinando o papel do microbioma intestinal no vazamento anastomótico e os resultados são aguardados. ⁷³

Conclusão

Existe uma associação significativa entre o microbioma intestinal e o CCR, com destaque para Fusobacterium (gênero) e F. nucleatum (espécies). Essa associação parece existir mais nos estágios avançados do tumor e / ou adenoma e é frequentemente associada a pior prognóstico e menor sobrevida.

Existem vários modelos preditivos de diagnóstico aprimorados pelo microbioma, mas é necessária uma validação prospectiva adicional antes da recomendação para uso na prática clínica.

Há pesquisas promissoras, porém limitadas, sobre o impacto do microbioma intestinal e da terapia, mas são necessárias mais pesquisas nessa área.

Autores: Mari Uyeda¹, Paulo Moreira², Itamar Souza Oliveira-Junior³ e Adrianos Loverdos⁴ 

Abreviações

Referências Bibliográficas

1 - Sun CH, Li BB, Wang B, Zhao J, Zhang XY, Li TT, Li WB, Tang D, Qiu MJ, Wang XC, Zhu CM, Qian ZR. The role of Fusobacterium nucleatum in colorectal cancer: from carcinogenesis to clinical management. Chronic Dis Transl Med. 2019 Oct 1;5(3):178-187.

2 - Brenner H, Kloor M, Pox CP. Colorectal cancer. The Lancet. 2014 Apr 26;383(9927):1490–502.

3 - Haggar FA, Boushey RP. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin Colon Rectal Surg. 2009 Nov;22(4):191–7

4 - Bernie T, Les I, Paul G, Jan K, David W, Chris S. A systematic review of the effects of screening for colorectal cancer using the faecal occult blood test, Hemoccult. BMJ. 1998 Aug 29;317(7158):559–65.

5 - Moreno CC, Mittal PK, Sullivan PS, Rutherford R, Staley CA, Cardona K, et al. Colorectal Cancer Initial Diagnosis: Screening Colonoscopy, Diagnostic Colonoscopy, or Emergent Surgery, and Tumor Stage and Size at Initial Presentation. Clin Colorectal Cancer. 2016 Mar 1;15(1):67–73.

6 - Bowel cancer incidence statistics [Internet]. Cancer Research UK. 2015 [Analisado em 21 out 2020]. Available from: http://www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/statistics-by-cancer-type/bowel-cancer/incidence

7 - Siegel RL, Fedewa SA, Anderson WF, Miller KD, Ma J, Rosenberg PS, et al. Colorectal Cancer Incidence Patterns in the United States, 1974–2013. JNCI J Natl Cancer Inst [Internet].  [Analisado em 21 out 2020];109(8). Available from: https://academic.oup.com/jnci/article/109/8/djw322/3053481

8 - Bowel cancer survival statistics [Internet]. Cancer Research UK. 2015 [Analisado em 21 out 2020]. Available from: http://www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/statistics-by-cancer-type/bowel-cancer/survival

9 - Strum WB. Colorectal Adenomas. N Engl J Med. 2016 Mar 17;374(11):1065–75.

10 - Talseth-Palmer BA. The genetic basis of colonic adenomatous polyposis syndromes. Hered Cancer Clin Pract. 2017 Mar 16; 15:5.

11 - Chang L, Chang M, Chang HM, Chang F. Expending Role of Microsatellite Instability in Diagnosis and Treatment of Colorectal Cancers. J Gastrointest Cancer. 2017 Dec 1;48(4):305–13.

12 - Yamane L, Scapulatempo-Neto C, Reis RM, Guimarães DP. Serrated pathway in colorectal carcinogenesis. World J Gastroenterol WJG. 2014 Mar 14;20(10):2634.

13 - Fan P, Li L, Rezaei A, Eslamfam S, Che D, Ma X. Metabolites of Dietary Protein and Peptides by Intestinal Microbes and their Impacts on Gut. Curr Protein Pept Sci. 2015;16(7):646–54

14 - Malago JJ. Contribution of microbiota to the intestinal physicochemical barrier. Benef Microbes. 2015;6(3):295–311.

15 - Littman DR, Pamer EG. Role of the commensal microbiota in normal and pathogenic host immune responses. Cell Host Microbe. 2011 Oct 20;10(4):311–23.

16 - Singh RK, Chang H-W, Yan D, Lee KM, Ucmak D, Wong K, et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. J Transl Med. 2017 Apr 8;15(1):73.

17 - Monda V, Villano I, Messina A, Valenzano A, Esposito T, Moscatelli F, et al. Exercise Modifies the Gut Microbiota with Positive Health Effects. Oxid Med Cell Longev. 2017; 2017:3831972.

18 - Rothschild D, Weissbrod O, Barkan E, Kurilshikov A, Korem T, Zeevi D, et al. Environment dominates over host genetics in shaping human gut microbiota. Nature. 2018 Mar;555(7695):210–5.

19 - Albenberg L, Esipova TV, Judge CP, Bittinger K, Chen J, Laughlin A, et al. Correlation Between Intraluminal Oxygen Gradient and Radial Partitioning of Intestinal Microbiota. Gastroenterology. 2014 Nov 1;147(5):1055-1063.e8.

20 - Eid N, Enani S, Walton G, Corona G, Costabile A, Gibson G, et al. The impact of date palm fruits and their component polyphenols, on gut microbial ecology, bacterial metabolites and colon cancer cell proliferation. J Nutr Sci. 2014;3:e46.

21 - Jurjus A, Eid A, Al Kattar S, Zeenny MN, Gerges-Geagea A, Haydar H, et al. Inflammatory bowel disease, colorectal cancer and type 2 diabetes mellitus: The links. BBA Clin. 2016 Jun; 5:16–24.

22 - Borges-Canha M, Portela-Cidade JP, Dinis-Ribeiro M, Leite-Moreira AF, Pimentel-Nunes P. Role of colonic microbiota in colorectal carcinogenesis: a systematic review. Rev Espanola Enfermedades Dig Organo Of Soc Espanola Patol Dig. 2015 Nov;107(11):659–71.

23 - Gharbia SE, Shah HN, Lawson PA, Haapasalo M. Distribution and frequency of Fusobacterium nucleatum subspecies in the human oral cavity. Oral Microbiol Immunol. 1990 Dec;5(6):324–7.

24 - Kostic AD, Chun E, Robertson L, Glickman JN, Gallini CA, Michaud M, et al. Fusobacterium nucleatum potentiates intestinal tumorigenesis and modulates the tumor-immune microenvironment. Cell Host Microbe. 2013 Aug 14;14(2):207–15.

25 - Rubinstein MR, Wang X, Liu W, Hao Y, Cai G, Han YW. Fusobacterium nucleatum promotes colorectal carcinogenesis by modulating E-cadherin/β-catenin signaling via its FadA adhesin. Cell Host Microbe. 2013 Aug 14;14(2):195–206.

26 - Luo K, Zhang Y, Xv C, Ji J, Lou G, Guo X, Chen M, Zhang Y, Wei H, Guo M, Huang R, Yu S. Fusobacterium nucleatum, the communication with colorectal cancer. Biomed Pharmacother. 2019 Aug; 116:108988.

27 - Shenker BJ, Datar S. Fusobacterium nucleatum inhibits human T-cell activation by arresting cells in the mid-G1 phase of the cell cycle. Infect Immun. 1995 Dec;63(12):4830–6.

28 - Nosho K, Sukawa Y, Adachi Y, Ito M, Mitsuhashi K, Kurihara H, et al. Association of Fusobacterium nucleatum with immunity and molecular alterations in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 2016 Jan 14;22(2):557.

29 - Hashemi Goradel N, Heidarzadeh S, Jahangiri S, Farhood B, Mortezaee K, Khanlarkhani N, Negahdari B. Fusobacterium nucleatum and colorectal cancer: A mechanistic overview. J Cell Physiol. 2019 Mar;234(3):2337-2344.

30 - Gao Z, Guo B, Gao R, Zhu Q, Qin H. Microbiota disbiosis is associated with colorectal cancer. Front Microbiol [Internet]. 2015 [Analisado em 24 out 2020];6. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2015.00020/full

31 - Zhou Y, He H, Xu H, Li Y, Li Z, Du Y, et al. Association of oncogenic bacteria with colorectal cancer in South China. Oncotarget. 2016 Dec 6;7(49):80794.

32 - Castellarin M, Warren RL, Freeman JD, Dreolini L, Krzywinski M, Strauss J, et al. Fusobacterium nucleatum infection is prevalent in human colorectal carcinoma. Genome Res. 2012 Feb 1;22(2):299–306.

33 - Kostic AD, Gevers D, Pedamallu CS, Michaud M, Duke F, Earl AM, et al. Genomic analysis identifies association of Fusobacterium with colorectal carcinoma. Genome Res. 2012 Feb 1;22(2):292–8.

34 - Tahara T, Yamamoto E, Suzuki H, Maruyama R, Chung W, Garriga J, et al. Fusobacterium in Colonic Flora and Molecular Features of Colorectal Carcinoma. Cancer Res. 2014 Mar 1;74(5):1311–8.

35 - Flanagan L, Schmid J, Ebert M, Soucek P, Kunicka T, Liska V, et al. Fusobacterium nucleatum associates with stages of colorectal neoplasia development, colorectal cancer and disease outcome. Eur J Clin Microbiol Infect Dis Off Publ Eur Soc Clin Microbiol. 2014 Aug;33(8):1381–90.

36 - Wei Z, Cao S, Liu S, Yao Z, Sun T, Li Y, et al. Could gut microbiota serve as prognostic biomarker associated with colorectal cancer patients’ survival? A pilot study on relevant mechanism. Oncotarget. 2016 Jul 19;7(29):46158.

37 - Yan X, Liu L, Li H, Qin H, Sun Z. Clinical significance of Fusobacterium nucleatum, epithelial-mesenchymal transition, and cancer stem cell markers in stage III/IV colorectal cancer patients [Internet]. OncoTargets and Therapy. 2017 [Analisado em 24 out 2020]. Available from: https://www.dovepress.com/clinical-significance-of-Fusobacterium-nucleatum-epithelial-mesenchyma-peer-reviewed-article-OTT

38 - Wu S, Lim KC, Huang J, Saidi RF, Sears CL. Bacteroides fragilis enterotoxin cleaves the zonula adherens protein, E-cadherin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Dec 8;95(25):14979–84.

39 - Wick EC, Rabizadeh S, Albesiano E, Wu X, Wu S, Chan J, et al. Stat3 activation in murine colitis induced by enterotoxigenic bacteroides fragilis. Inflamm Bowel Dis. 2014 May;20(5):821–34

40 - Boleij A, Hechenbleikner EM, Goodwin AC, Badani R, Stein EM, Lazarev MG, et al. The Bacteroides fragilis Toxin Gene Is Prevalent in the Colon Mucosa of Colorectal Cancer Patients. Clin Infect Dis. 2015 Jan 15;60(2):208–15.

41 - Tsoi H, Chu ESH, Zhang X, Sheng J, Nakatsu G, Ng SC, et al. Peptostreptococcus anaerobius Induces Intracellular Cholesterol Biosynthesis in Colon Cells to Induce Proliferation and Causes Dysplasia in Mice. Gastroenterology. 2017 May 1;152(6):1419-1433.e5.

42 - Chen W, Liu F, Ling Z, Tong X, Xiang C. Human Intestinal Lumen and Mucosa-Associated Microbiota in Patients with Colorectal Cancer. PLOS ONE. 2012 Jun 28;7(6):e39743.

43 - Ahn J, Sinha R, Pei Z, Dominianni C, Wu J, Shi J, et al. Human Gut Microbiome and Risk for Colorectal Cancer. JNCI J Natl Cancer Inst. 2013 Dec 18;105(24):1907–11.

44 - Rivière A, Selak M, Lantin D, Leroy F, Vuyst LD. Bifidobacteria and Butyrate-Producing Colon Bacteria: Importance and Strategies for Their Stimulation in the Human Gut. Front Microbiol [Internet]. 2016 [Analisado em 24 out 2020];7. Available from: /pmc/articles/PMC4923077/

45 - Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, Lakhdari O, Bermúdez-Humarán LG, Gratadoux J-J, et al. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc Natl Acad Sci. 2008 Oct 28;105(43):16731–6.

46 - Marchesi JR, Dutilh BE, Hall N, Peters WHM, Roelofs R, Boleij A, et al. Towards the Human Colorectal Cancer Microbiome. PLOS ONE. 2011 May 24;6(5):e20447.

47 - Kunzmann AT, Proença MA, Jordao HW, Jiraskova K, Schneiderova M, Levy M, Liska V, Buchler T, Vodickova L, Vymetalkova V, Silva AE, Vodicka P, Hughes DJ. Fusobacterium nucleatum tumor DNA levels are associated with survival in colorectal cancer patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2019 Oct;38(10):1891-1899.

48 - Wang F, Li Q, Wang C, Tang C, Li J. Dynamic Alteration of the Colonic Microbiota in Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury. PLOS ONE. 2012 Jul 27;7(7):e42027.

49 - Jalanka J, Salonen A, Salojärvi J, Ritari J, Immonen O, Marciani L, et al. Effects of bowel cleansing on the intestinal microbiota. Gut. 2015 Oct 1;64(10):1562–8.

50 - Gralka E, Luchinat C, Tenori L, Ernst B, Thurnheer M, Schultes B. Metabolomic fingerprint of severe obesity is dynamically affected by bariatric surgery in a procedure-dependent manner. Am J Clin Nutr. 2015 Dec;102(6):1313–22.

51 - Gaines S, Shao C, Hyman N, Alverdy JC. Gut microbiome influences on anastomotic leak and recurrence rates following colorectal cancer surgery. Br J Surg. 2018 Jan;105(2):e131–41.

52 - Liberati A, Altman DG, Tetzlaff J, Mulrow C, Gøtzsche PC, Ioannidis JPA, et al. The PRISMA statement for reporting systematic reviews and meta-analyses of studies that evaluate healthcare interventions: explanation and elaboration. BMJ. 2009 Jul 21;339:b2700.

53 - Higgins J, Green S. Cochrane Handbook for Systematic Reviews of Interventions, Version 5.1.0 [Updated March 2011] The Cochrane Collaboration [Internet]. 2011 [Analisado em 24 out 2020]. Available from: http://handbook-5-1.cochrane.org/

54 - Flemer B, Lynch DB, Brown JMR, Jeffery IB, Ryan FJ, Claesson MJ, et al. Tumour-associated and non-tumour-associated microbiota in colorectal cancer. Gut. 2017 Apr 1;66(4):633.

55 - Allali I, Delgado S, Marron PI, Astudillo A, Yeh JJ, Ghazal H, et al. Gut microbiome compositional and functional differences between tumor and non-tumor adjacent tissues from cohorts from the US and Spain. Gut Microbes. 2015 May 4;6(3):161–72.

56 - Burns MB, Lynch J, Starr TK, Knights D, Blekhman R. Virulence genes are a signature of the microbiome in the colorectal tumor microenvironment. Genome Med. 2015 Jun 24; 7:55.

57 - Nakatsu G, Li X, Zhou H, Sheng J, Wong SH, Wu WKK, et al. Gut mucosal microbiome across stages of colorectal carcinogenesis. Nat Commun. 2015 Oct 30; 6:8727.

58 - Xu K, Jiang B. Analysis of Mucosa-Associated Microbiota in Colorectal Cancer. Med Sci Monit. 2017 Sep 14; 23:4422–30.

59 - Yu Y-N, Yu T-C, Zhao H-J, Sun T-T, Chen H-M, Chen H-Y, et al. Berberine may rescue Fusobacterium nucleatum-induced colorectal tumorigenesis by modulating the tumor microenvironment. Oncotarget. 2015 Oct 13;6(31):32013.

60 - Amitay EL, Werner S, Vital M, Pieper DH, Höfler D, Gierse I-J, et al. Fusobacterium and colorectal cancer: causal factor or passenger? Results from a large colorectal cancer screening study. Carcinogenesis. 2017 Aug 1;38(8):781–8.

61 - Zackular JP, Rogers MAM, Ruffin MT, Schloss PD. The Human Gut Microbiome as a Screening Tool for Colorectal Cancer. Cancer Prev Res (Phila Pa) [Internet]. 2014 Aug 7 [Analisado em 24 out 2020]; Available from: http://cancerpreventionresearch.aacrjournals.org/content/early/2014/08/06/1940-6207.CAPR-14-0129

62 - Liang JQ, Chiu J, Chen Y, Huang Y, Higashimori A, Fang J-Y, et al. Fecal Bacteria Act as Novel Biomarkers for Non-Invasive Diagnosis of Colorectal Cancer. Clin Cancer Res [Internet]. [Analisado em 28 out 2020]; Available from: http://clincancerres.aacrjournals.org/content/early/2016/10/01/1078-0432.CCR-16-1599.abstract

63 - McCoy AN, Araújo-Pérez F, Azcárate-Peril A, Yeh JJ, Sandler RS, Keku TO. Fusobacterium Is Associated with Colorectal Adenomas. PLOS ONE. 2013 Jan 15;8(1):e53653.

64 - Mima K, Nishihara R, Qian ZR, Cao Y, Sukawa Y, Nowak JA, et al. Fusobacterium nucleatum in colorectal carcinoma tissue and patient prognosis. Gut. 2016 Dec 1;65(12):1973–80.

65 - Yu T, Guo F, Yu Y, Sun T, Ma D, Han J, et al. Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy. Cell. 2017 Jul 27;170(3):548-563.e16.

66 - Zeller Georg, Tap Julien, Voigt Anita Y, Sunagawa Shinichi, Kultima Jens Roat, Costea Paul I, et al. Potential of fecal microbiota for early‐stage detection of colorectal cancer. Mol Syst Biol. 2014 Nov 28;10(11):766.

67 - Arnold M, Sierra MS, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut. 2016 Jan 5; gutjnl-2015-310912.

68 - Hussan H, Clinton SK, Roberts K, Bailey MT. Fusobacterium’s link to colorectal neoplasia sequenced: A systematic review and future insights. World J Gastroenterol. 2017 Dec 28;23(48):8626–50.

69 - Feng Q, Liang S, Jia H, Stadlmayr A, Tang L, Lan Z, et al. Gut microbiome development along the colorectal adenoma–carcinoma sequence. Nat Commun. 2015 Mar 11; 6:6528.

70 - Dejea CM, Wick EC, Hechenbleikner EM, White JR, Welch JLM, Rossetti BJ, et al. Microbiota organization is a distinct feature of proximal colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci. 2014 Dec 23;111(51):18321–6.

71 - Flemer B, Warren RD, Barrett MP, Cisek K, Das A, Jeffery IB, et al. The oral microbiota in colorectal cancer is distinctive and predictive. Gut. 2017 Oct 7; gutjnl-2017-314814.

72 - Mima K, Cao Y, Chan AT, Qian ZR, Nowak JA, Masugi Y, et al. Fusobacterium nucleatum in Colorectal Carcinoma Tissue According to Tumor Location. Clin Transl Gastroenterol. 2016 Nov;7(11):e200.

73 - ISRCTN - ISRCTN13334746: IntAct- IFA to prevent anastomotic leak in rectal cancer surgery [Internet]. [Analisado em 03 nov 2020]. Available from: https://www.isrctn.com/ISRCTN13334746?q=&filters=conditionCategory:Cancer&sort=&offset=5&totalResults=1937&page=1&pageSize=10&searchType=basic-search