Em artigo exclusivo, Ilana R Zalcberg, pesquisadora principal do Laboratório de Biologia Molecular CEMO-INCA e Cristiana Solza, professora adjunta de hematologia no Hospital Universitário Pedro Ernesto, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) abordam o panorama do mieloma múltiplo (MM). Segundo as especialistas, embora as plataformas de alta performance e resolução,quando utilizadas na onco-hematologia, tenham expandido nosso conhecimento em relação ao mecanismo das doenças e tratamento, elas ainda apresentam lacunas em relação à metodologia, normalização e infraestrutura necessárias para a translação definitiva desse conhecimento para a prática clínica.
Em artigo exclusivo, Ilana R Zalcberg, pesquisadora principal do Laboratório de Biologia Molecular CEMO-INCA e Cristiana Solza, professora adjunta de hematologia no Hospital Universitário Pedro Ernesto, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) abordam o panorama do mieloma múltiplo (MM). Segundo as especialistas, embora as plataformas de alta performance e resolução,quando utilizadas na onco-hematologia, tenham expandido nosso conhecimento em relação ao mecanismo das doenças e tratamento, elas ainda apresentam lacunas em relação à metodologia, normalização e infraestrutura necessárias para a translação definitiva desse conhecimento para a prática clínica.
Autores*: Ilana R Zalcberg e Cristiana Solza
O Mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela presença de células plasmáticas clonais na medula óssea, além de sinais sistêmicos como anemia, hipercalcemia, insuficiência renal e lesões ósseas líticas1. Ele representa 10% de todas as neoplasias hematológicas e possui uma incidência ajustada pela idade de aproximadamente 4 novos casos para cada 100.000 indivíduos2. O MM é uma doença heterogênea com alguns pacientes falecendo poucas semanas após o diagnóstico, enquanto outros vivem por mais de 10 anos3. Ele costuma ser precedido por um estágio pré maligno assintomático chamado de gamopatia monoclonal de significado indeterminado (GMSI), que progride para mieloma ou outras neoplasias relacionadas em uma taxa em torno de 1% ao ano4,5. Os pacientes com GMSI são assintomáticos por definição, mas apresentam uma concentração mensurável de proteína monoclonal ou alteração no teste de cadeias leves livres6.
Durante a última década, muitos progressos foram feitos nas estratégias de tratamento do MM com o desenvolvimento de regimes terapêuticos que incorporaram o inibidor de proteossoma bortezomibe e drogas imunomoduladoras (IMiDs) como a talidomida.1,7,8
O resultado do tratamento no MM é muito variável e um melhor entendimento dos fatores que influenciam a biologia da doença é essencial para conhecer e predizer o comportamento da doença em cada indivíduo9. Está ficando cada vez mais evidente que o MM não é uma doença única, mas ao invés disto, compreende múltiplas doenças com diferenças em seus desfechos que são definidos de acordo com o seu perfil genético. A identificação dos fatores responsáveis por estas diferenças na biologia da doença tem grande importância caso seja nosso desejo melhorar ainda mais os resultados do tratamento do MM9.
CLASSIFICAÇÃO DO MM
O MM é uma doença heterogênea, subtipos foram caracterizados tendo como base características genético-moleculares utilizadas em diferentes esquemas de classificação. Esses são baseados nas características biológicas, no valor prognóstico e na predição da resposta terapêutica. As anormalidades genéticas e epigenéticas subjacentes ao MM quandoincorporadas aos esquemas de classificação auxiliam na discriminação de grupos homogêneos quanto ao comportamento clínico e a resposta terapêutica10,11.
A classificação biológica é caracterizada por alterações genéticas observadas desde as fases pré-malignas da gamopatia monoclonal de significado indeterminado (GMSI) até a fase maligna propriamente dita (MM sintomático e avançado). Biologicamente o MM pode ser dividido em 2 grandes grupos: mieloma hiperdiplóide (H-MM) e não-hiperdiplóide (NH-MM).
Mieloma Hiperdiplóide (H-MM): é caracterizado por trissomias principalmente com acometimento dos cromossomas ímpares (3,5,7,9,11,15,19 e 21), baixa prevalência de deleção no cromossoma 13 (del13) e em alterações envolvendo o locus da cadeia pesada da Imunoglobulina (IgH) na região 14q32. Pacientes com H-MM apresentam melhor prognóstico quando comparados a pacientes com NH-MM12.
Em contraste, mieloma não- hiperdiplóide (NH-MM) é caracterizado pela alta frequência de del13 e de translocações primárias no locus da IgH na região 14q32. As principais translocações observadas são: t (4;14) (p16; q32), t (11;14) (q13; q32) e t (14;16) (q32; q23). Estas alterações ativam os proto- oncogenes localizados nas regiões cromossômicas 4p16 [MMSET- FGFR3]; 11p13 [ciclina D1 -CCND1]; e 16q23 [MAF]. A frequência destas alterações é de 15%, 15% e 5%, respectivamente. Algumas alterações ocorrem em frequências <5% e acometem as regiões 6p21 [CCND3] e 20q1 [MAFB]10.
Esta classificação biológica, baseada na identificação de alterações genéticas permitiu agrupar pacientes com resposta terapêutica homogênea aos tratamentos convencionais (quimioterapia em altas doses com agentes alquilantes) seguidas ou não de transplante autólogo de células tronco hematopoéticas (TACTH). O valor prognóstico destes marcadores genéticos para predizer a resposta terapêutica a novas modalidades de tratamento, tais como os inibidores do proteosoma (bortezomibe e carfilzomibe) e dos medicamentos imunomoduladores-IMiDs (lenaliomida e pomalidomida) parece beneficiar pacientes de alto risco de falha terapêutica para o tratamento convencional. Pacientes de alto risco são aproximadamente 25% dos casos de MM e portadores das seguintes alterações genéticas: del17p, t (4;14); t (14;16) detectadas por FISH e del13 e hipodiploidia (<45 cromossomos)12.
ALTERAÇÕES GENÉTICAS COM VALOR PROGNÓSTICO
Translocação t (4;14) (p16; q32)
A translocação t (4;14) é observada em 15% dos pacientes e resulta na superexpressão dos genes FGFR3 e MMSET13,14.Por acometer a porção mais telomérica do cromossomo 4 a técnica mais indicada para sua detecção é o FISH, sendo que o a procura da alteração por citogenética convencional está associada a uma frequência muito elevada de falso negativos13,14.Diferentes grupos mostraram que essa alteração está associada a doença agressiva e menor sobrevida independente da modalidade terapêutica utilizada15,16.Pacientes portadores dessa alteração, em uso de quimioterapia de altas doses, apresentam remissão mais curta quando comparados aqueles sem a alteração17,18.Além disso, doença primária refratária e recidivas precoces ao tratamento com agentes alquilantes e esteróides têm sido relatadas nesse grupo19.O valor prognóstico adverso dessa alteração em séries de pacientes tratados com bortezomibe foiquestionado1. Entretanto, estudos de grupos espanhóis e franceses confirmaram recentemente o prognóstico desfavorável atribuído pela t (4;14).
Translocaçãot (14;16) (q32; q23) e outras alterações de MAF
A t (14;16) é observada em 5-7 % dos casos de MM e resulta na super expressão do gene MAF. Pacientes portadores dessa alteração apresentam doença agressiva e prognóstico adverso, independente do esquema terapêutico utilizado16. Pela baixa frequência da alteração, o estabelecimento do valor prognóstico independente dessa alteração foi questionado. Entretanto, em trabalho recente o grupo francês de MM mostrou o valor prognóstico adverso da t (14;16), e também de outras alterações envolvendo o gene MAF t (14;20uu), na probabilidade de sobrevida de pacientes com MM20.
Translocaçãot (11;14) (q13; q32)
A translocação t (11;14) é observada em 15% dos pacientese resulta na superexpressão de ciclina D1. Pacientes portadores dessa alteração apresentam prognóstico favorável, mieloma do tipo IgG, alta expressão de CD20 com 50% dos pacientes também positivos para mutação em Kras. Esta alteração está raramente associada a del13 e pode ser observada em fases precoces da doença (MGUS). Os casos positivos para a t (11;14) apresentam morfologia linfoplasmacítica (LPL) e maior comprometimento ósseo (DKK1)21.
ALTERAÇÕES GENÉTICAS SECUNDÁRIAS
Deleção 17p13
A deleção 17p13 é observada em 5-10% dos casos de MM e segue sendo a alteração de maior valor adverso, porque possivelmente a região deletada acomete o gene TP5315,16,22. As del 17p13 são normalmente mono alélicas. Pacientes portadores dessa alteração apresentam maior frequência de doença extra medular (plasmocitoma), hipercalcemia15,16,22, e envolvimento do sistema nervoso central (SNC) caracterizando uma doença altamente agressiva23.
Amplificação de 1q
Embora de alta prevalência e associada a prognóstico adverso, a detecção dessa alteração não faz parte dos algoritmos prognósticos utilizados atualmente24. Assinaturas de expressão gênica (GEP) utilizadas para prognóstico de pacientes com MM comportam múltiplos genes situados nessa região. Entretanto até o momento não está estabelecido qual o gene alvo dessa alteração.
Deleção e Monossomiado 13
A deleção do cromossomo 13 é observada em aproximadamente 50% dos casos de MM recém - diagnosticados. A prevalência similar em casos de GMSI e MM é indicativa de que essa alteração seja um evento inicial na patogênese da doença. Apresenta valor prognóstico adverso quando detectada pela citogenética. Entretanto, quando detectada por FISH esse valor não é suficiente para classificar o paciente no alto risco, mas no risco intermediário. Dessa forma, o valor adverso da deleção do 13 só pode ser considerado se a detecção for pela citogenética convencional. Pela alta associação da del13 a t (4;14)25,26 e a deleção do Cr17 não é possível definir se de fato o prognóstico adverso pode ser atribuído a essa alteração ou a sua co-ocorrência com alterações de alto valor adverso27,28.
As recomendações do Grupo Internacional de Estudo do Mieloma (IMWG) quanto a estratificação de risco de pacientes com MM, visando a individualização terapêutica se baseia na identificação por FISH de 3 marcadores associados ao alto risco, que são, ganho na região1q21, perda de 17p13, e detecção da fusão IGH/FGFR3 resultante da t (4;14)29.
As deleções em 12p, 6q, 8p, 14q, 16q e 22q e em X são também aberrações comuns no MM.
Deleções do braço curto do cromossoma 12 são identificadas em aproximadamente 12% dos pacientes com MM e são associadas a uma menor sobrevida livre de eventos e global3.
Vale ressaltar, que os ensaios de FISH devem ser realizados em população de células plasmáticas purificadas. Essas podem ser identificadas por meio de combinação de FISH com marcação fluorescente de cadeia leve ou alternativamente pelo isolamento positivo de células plasmáticas com colunas utilizando-se beads magnéticos CD138.
TÉCNICAS GENÔMICAS DE ALTA RESOLUÇÃO
Até o momento não há descrição no MM de que exista um marcador ou alteração fundadora responsável pela sua patogênese. Dessa maneira a individualização terapêutica é necessária para diferentes subgrupos moleculares de MM. O sucesso de uma terapia para o paciente de MM deverá estar associado ao entendimento da biologia de um caso em particular. A análise integrada pela utilização de diferentes metodologias genômicas que inclua a definição do perfil de expressão gênica, definição de alterações numéricas e estruturais, perfil de metilação do DNA, além de mutações acionáveis para o uso de terapias alvo específicas será cada vez mais introduzida na prática clínica.
Plataformas de Hibridização Genômica Comparativa (A-CGH)
Essa tecnologia, avalia a variação do número de cópias de uma amostra de DNA. Estudos recentes têm utilizado plataformas de A-CGH e de SNP (polimorfismo de nucleotídeo simples) na tentativa de substituir e ampliar as alterações genéticas de valor prognóstico para o MM. Um estudo recente, baseado no A-CGH, propôs uma classificação em 3 grupos prognósticos baseada na combinação dos níveis de β2 microglobulina, ganhos na região 5q e deleção da região 12p33. Existe uma discussão atual, se o A-CGH pode substituir os critérios atuais de classificação. A principal limitação do uso do A-CGH é que esta técnica não detecta translocações, e desta maneira não é capaz de aferir, por exemplo, a presença de translocações envolvendo o locus da cadeia pesada da IgH. Dessa maneira, o A-CGH, se introduzido na clínica, deverá ser acrescentado, e não substituir, o algoritmo diagnóstico atual (FISH).
Perfil de Expressão Gênica (GEP)
O uso do GEP para estratificação do MM é útil para a discriminação de sub-grupos homogêneos em relação a falha terapêutica e características clínicas e biológicas. Foram identificados dois sets de genes que servem para estratificar os pacientes tratados homogeneamente em grupos de alto e baixo risco. Entretanto, até o momento essa discriminação ainda não foi validada em pacientes tratados com inibidores do proteossoma e IMiDs. É de se ressaltar, que o GEP é bastante exato para a detecção de translocações que acometem a região 14q32 da IgH pela identificação de altos níveis de expressão dos genes parceiros, entretanto o GEP não detecta deleções em 17p30.
Sequenciamento de Próxima geração (NGS)
O sequenciamento completo do genoma (WES) de amostras de MM evidenciou uma alta frequência (37%) de mutações afetando a via NF-KB, em KRAS (50%) e TP53 (8%). Além disso mutações em genes responsáveis pela tradução de proteínas (43%), pela codificação das enzimas modificadoras das histonas (HOXA9) e envolvidos na coagulação (16%) também foram observadas.
Em trabalho recente o grupo de Braggio na Mayo Clinic31, realizou um sequenciamento sitio dirigido para 47 alvos em estudo longitudinal com 25 pacientes utilizando amostras do diagnóstico e ao longo da terapia. Análise do status mutacional dos genes contidos no painel específico para MM (M3P) revelou que mutações em Kras foram as mais frequentes em qualquer tempo avaliado, seguidas de NRAS (20-16% variação de frequência entre o diagnóstico e ao longo do tratamento), TP53 (16 %), DIS3 (16 %), FAM46C (12 - 16 %), e SP140 (12 %). Alguns aspectos interessantes observados nesse trabalho foram: (i) a presença de 1 clone majoritário ao diagnóstico além de outros 4; (ii) evolução clonal com identificação de ganhos e/ou perdas nos genes FAM46C, FAT1, KRAS, NRAS, SPEN, PRDM1, NEB e TP53; além da expansão de clones positivos para mutações no gene XBP1 associadas a resistência ao bortezomibe.
EPIGENÉTICA E O USO DE AGENTES HIPOMETILANTES
A desregulação de mecanismos epigenéticos desempenha um papel crucial no desenvolvimento e progressão do câncer, incluindo o MM. Estudos para a determinação do perfil global de metilação no MM, mostraram que a hipometilação é um evento precoce na patogênese da doença e que o grau de hipometilação aumenta durante a progressão da doença. Em contraste a hipermetilação de genes parece ser um evento raro no MM32.Ainda que seja considerada um evento raro, a hipermetilação de genes parece estar associada com a progressão da doença, de GMSI para MM e para leucemia de células plasmáticas (LCP)33.A metilação de alguns genes está associada com um prognóstico adverso em pacientes com MM sendoos genes mais afetados: SPARC, BNIP3, DAPK, RAR beta, EGLN3, DCL-1, CDH-1, DCC, TGF betaR2, CD9 e p1634,35,36.
Kaiser e colaboradores, combinando dados do perfil de metilação do DNA e de expressão gênica identificaram alguns genes cuja expressão diminuída está associada a desregulação de mecanismos epigenéticos, são eles GPX3, RBPI, SPARC e TGFBI. A hipermetilação dos promotores com perda de função desses genes está associada com uma sobrevida global significativamente menor, independente da idade, do ISS (International Staging System Score), e da citogenética37. Estes 4 genes desempenham importantes funções de supressão tumoral incluindo resposta a quimioterapia (TGFBI), interação com o microambiente tumoral (SPARC), sinalização do ácido retinóico (RBPI), e resposta ao stress oxidativo (GPX3). Pacientes com hipermetilação de TGFBI tiveram uma sobrevida global mediana de 25,7 meses em comparação com 50,9 meses nos casos com baixa metilação37. Uma associação entre metilação de TGFBI e a t (4;14) foi relatada nesse mesmo estudo.
O gene SPARC/Osteonectin codifica uma proteína associada à matriz que intermedia interações das células com a matrizextracellular38,39. De grande interesse para pacientes com mieloma, foi a descrição de que a expressão de SPARC tem sido associada a resposta a lenalidomida em pacientes com mielodisplasia e portadores de deleção na região 5q-40.Heller e colaboradores, relataram a associação da metilação do gene SPARC com um prognóstico adverso no mieloma, um achado que enfatiza o significado prognóstico das mutações em SPARC e está de acordo com os resultados descritos por Kaiser41.
Nojima e colaboradores mostraram que a metilação de RASD1 estava fortemente associada com resistência a dexametasona em células de pacientes com MM42. O gene RASD1 foi originalmente identificado como um gene induzível pela dexametasona43. Este estudo mostrou que a expressão do RASD1 não foi induzida pela dexametasona em células de MM que apresentavam metilação do RASD142.
CONCLUSÃO
Uma verdadeira revolução ocorreu no estudo das neoplasias hematológicas com um número substancial de publicações e descobertas nos últimos anos. Descobertas significativas associadas ao diagnóstico da doença, prognóstico, evolução clonal e intervenção terapêutica foram realizadas a partir da introdução de tecnologias de alta resolução. Como resultado, essas tecnologias irão, em futuro próximo, se tornar parte dos testes clínicos de rotina e o desafio será finalmente fazer a transição com êxito das técnicas atuais para as desenvolvidas com base nas novas tecnologias. No campo do MM vale perguntar quando e se as metodologias atuais, empregadas para classificação dos pacientes, serão substituídas pelas novas tecnologias, como por exemplo, SNG, ACGH e GEP. Embora as plataformas de alta performance e resolução, quando utilizadas na onco-hematologia, tenham expandido nosso conhecimento em relação ao mecanismo das doenças e tratamento, elas ainda apresentam lacunas em relação à metodologia, normalização e infraestrutura necessárias para a translação definitiva desse conhecimento para a tomada de decisões clínicas.
Autores*: Ilana R Zalcberg é pesquisadora principal (PI) do Laboratório de Biologia Molecular CEMO-INCA
Cristiana Solza é professora adjunta de hematologia no Hospital Universitário Pedro Ernesto, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ)
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